APANAC - INDICASAT AIP 2016

ESTUDIOS SOBRE LA DINÁMICA Y ORGANIZACIÓN DE  LOS RECEPTORES DE ENDOTELINA TIPO A MEDIANTE MICROSCOPIA DE REFLEXION INTERNA (TIRF)

 

Nadir Planes 1,2, Michelle A. Digman3 , Enrico Gratton 3 , Catherina Caballero-

George 1

 

1. Instituto de investigaciones científicas y servicios de alta tecnológica; grupo de

investigaciones farmacéuticas 2. Universidad Acharya Nagarjuna; 3. Universidad de

California

 

Uno de los potentes vasoconstrictores del sistema cardiovascular es la endotelina 1 (ET-1) que actúa como una hormona paracrina y autocrina sobre los receptores acoplados a proteína G denominados endotelina A (ETA) y endotelina B (ETB). El estudio de los receptores mediante técnicas microscópicas ha permitido la determinación de parámetros como el coeficiente de difusión y la organización de los mismos, con los años se ha evidenciado que la organización de los GPCRs está relacionada estrechamente a sus propiedades funcionales y farmacológicas, tal es el caso del receptor Ácido γ-aminobutírico B (GABAB) 1 y 2 en donde es un pre-requisito que ambos receptores se expresen como heterómeros para un correcto plegamiento del receptor y su transporte a la membrana plasmática, además de para su señalización.

Para determinar el grado de oligomerización y coeficiente de difusión que presentan los receptores de ETA e identificar cuáles son sus comportamientos ante un agonista (ET-1) y dos antagonistas (BQ123 y Sitaxentan) a través del tiempo, se utilizó la microscopia fluorescente en modo de microscopia de reflexion interna para medir las fluctuaciones de intensidades en las partículas fluorescentes que se encuentran ubicadas en la membrana celular. Las células CHO-K1 transientemente transfectadas con ETA marcado con la proteína fluorescente verde (GFP) fueron analizadas antes y después de agregar los ligandos, utilizando el método de Número y Brillo (N&B), una técnica basada en el análisis de las fluctuaciones de fluorescencia para medir el brillo molecular de los receptores; y el método de “image mean square displacement” (iMSD). Nuestros resultados muestran que las células CHO-K1 transfectadas con el receptor de ETA antes y después de ser estimuladas con ET-1 presentaron variaciones en cuanto a las poblaciones de monómeros (B= 1.091; 58.2 ± 14.2% incrementan a 68.2 ± 7.0%), dímeros (B= 1.202; 38.1 ± 9.6% disminuyen a 30.6 ± 7.7%) y tetrámeros (B=1.355; 3.6 ± 4.8% disminuyen a 1.2 ± 0.7%). Sin embargo, la proporción de las poblaciones de los oligómeros de cuatro unidades o más permanecieron constantes luego de ser estimuladas con BQ123 y Sitaxentan.

Por otro lado, el análisis del iMSD mostro dos perfiles de trayectoria para el complejo ligando – receptor: una difusión heterogénea con un D= 0.012 ±0.004 y una difusión confinada de D= 0.005±0.002.

Basándonos en los resultados con los análisis del N& B podemos identificar una nueva organización de oligómeros (tetrámeros) que no han sido descritos para los receptores ETA en ensayos anteriores y para nuestro conocimiento a través de las revisiones biblio-gráficas este es la primera vez que se utiliza el método de iMSD para estudiar la dinámica de los ETA.

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