APANAC - INDICASAT AIP 2016

ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI PARA EL ANÁLISIS DE miRNA: UNA NUEVA POSIBILIDAD EN EL DIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSIS

 

Didio A Ortiz 1, Juan C. Rojas 1, Sara Rosero 1,3, Diego Reginensi 1, Rolando A. Gittens 1,2, Javier Sanchez Galan 1,2, Amador Goodridge 1,3,4

 

1. Centro de Biodiversidad y Descubrimiento de Drogas de INDICASAT-AIP, 2. Grupo de Investigación en Biotecnología, Bioinformática y Biología de Sistemas, Centro de Producción e Investigaciones Agroindustriales (CEPIA), Universidad Tecnológica de Panamá 3. Centro de Biología Celular y Molecular de las Enfermedades, INDICASAT-AIP 4. Programa de Control de Tuberculosis, Ministerio de Salud, Colón, Panamá

 

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa, causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb), que a nivel mundial aun representa una gran amenaza; Dentro de America Central, durante los últimos 20 años, Panamá ha sido el país que ha tenido la mayor tasa de mortalidad por TB. El mecanismo exacto por el cual la infección asintomática o latente (ITBL), pasa al estado activo de la infección, permanece aún indescifrado. Por lo tanto, nuestra batería de diagnósticos es aún, inadecuada para

identificar la infección en un estado más temprano y permitir el debido tratamiento a los pacientes, antes de que progresen al estado activo de la enfermedad. Distintas Biomoleculas, tal como el micro ARN (miARN) han demostrado jugar un papel importante en muchas interacciones patógeno huésped, demostrando así, la posibilidad de para su utilización como Biomarcadores. La continua optimización de técnicas de alta precisión como la espectrometría de masas MALDI, combinada con avances actuales en análisis bioinformáticos, han demos-trado ser herramientas de gran utilidad para un eficiente procesamiento de múltiples muestras y de la gran cantidad de data que proviene de ellas.

Este es un estudio preliminar que tiene como objetivo estandarizar el protocolo de MALDI-MS que será utilizado en la búsqueda de posibles Biopatrones propios de los estados de la infección por tuberculosis.

Se utilizó como muestra el miRNA sintético 365-5p (23nt MM=7499.5 Da), comparando dos diferentes matrices para MALDI: 2,4,6-Trihydroxyacetophenone (THAP) y 2,5-Dihydroxybenzoic acid (2,5-DHB) en los modos de ionización positivo y negativo. La estandarización del protocolo se hizo atendiendo a la calidad de resolución del espectro, y ésta se llevó a cabo en dos fases: Variando 1) El método de deposición (dried droplet y premix) y del rango matriz-muestra (1-1, 1-5, 1-10). Y 2) La concentración de la Matriz 2,5-DHB (20mg/mL y 10mg/mL). Los espectros obtenidos por ambas matrices mostraron el valor esperado de m/z (~7500 Da) fragmentos de menor valor de m/z. La mejor resolución de espectro obtenida hasta el momento ha sido utilizando la matriz 2,5-DHB en una concentración de 20mg/mL, con el método de deposición premix, rango matriz muestra 1-1, analizada en el modo de ionización positiva.

Como próxima fase, se comprobará la eficiencia de estas matrices contra 3-HPA, una tercera matriz de MALDI, y utilizando el estándar de calibración para oligonucleótidos (#206200) BRUKER dlt.

Lo cual nos permitirá proceder a la estandarización final y optimización del protocolo, y a la evaluación inicial de los patrones de fragmentación de éste y otros miARN sintéticos relacionados a este estudio.

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